Ungefähr in den ersten 13 Seiten des Drehbuchs lernt man den Sandman (Thomas Haden Church), den außerirdischen Symbionten und Harry Osborn (James Franco) als den Grünen Kobold II kennen. Der außerirdische Symbiont stammt aus einem Meteoriten, kommt zufällig mit Peter Parker (Tobey Maguire) in Berührung und folgt ihm nach Hause, ohne das dieser es merkt. So ist er dann in seiner Wohnung und lauert...
Wie auch immer. Wir sehen einen frühen Kampf mit dem Grünen Kobold II bei dem Spidey Arschtritte verpasst bekommt, nur damit sich dann alles wendet und der Grüne Kobold II in eine enge Gasse gestoßen wird, wo er mit dem Kopf voraus gegen ein Spinnennetz läuft, das ihn wie auf einer Wäscheleine aufhängt und fast tötet. Peter rettet ihn und Harry erinnert sich nicht an viel. Also kreidet der Comicwelt einen weiteren Gedächtnisschwund an! Flint verwandelt sich in den Sandman, als er in ein Molekültestgelände gejagt wird und bum... wird er zum Sandman.
Mary Janes (Kirsten Dunst) Karriere läuft nicht so prickelnd und sie ist ein bisschen neidisch auf all den Ruhm, den Spidey erntet. Gleichzeitig versucht Peter einen Weg zu finden, MJ einen Heiratsantrag zu machen. Gwen Stacy (Bryce Dallas Howard) erscheint als Peter Parkers Tutorin, da sie beide Dr. Connors (Dylan Baker) Klasse besuchen. Sie wird im Drehbuch auch als Flittchen dargestellt und traf sich früher mit Eddie Brock (Topher Grace), aber es war nichts ernstes. Auch lernt sie Spider-Man während eines "Spider-Man Day"-Events kennen und küsst ihn kopfüber. Diese ganze Sache dauert nicht lange, da Sandman einen Geldtransporter entführt. Spider-Man taucht auf und versucht den Tag zu retten. Stellt euch diesen Kampf wie den Sandsturm aus "Die Mumie kehrt zurück" vor. Der Kampf endet damit, dass Sandman flüchtet, jedoch nicht bevor Brock einen Schnappschuss von einem "besiegten" Spider-Man macht. Als Peter herausfindet, wie er MJ einen Antrag machen kann, geht er mit ihr in ein Café. Gwen kommt rein, nur um zu fragen, ob er dieses Bild hat, auf dem sie Spider-Man kopfüber küsst. Das gefällt MJ ganz und gar nicht.
Randbemerkung: Brock, der laut Drehbuch erst eine Woche zuvor eingestellt wurde (was schon ein Fehler ist), und Peter kämpfen um eine der festen Stellen beim Daily Bugle. Beide schießen Fotos von Spider-Man, doch nur Brocks stellen ihn in kein gutes Licht. Gleichzeitig werden Tante May (Rosemary Harris) und Peter aufs Polizeirevier gerufen, wo sie schockierende Nachrichten erhalten: Es scheint, dass Onkel Bens (Cliff Robertson) Mörder aus dem ersten Film eigentlich gar nicht sein Mörder ist, sondern nur ein Handlanger. Der wahre Mörder ist... wie vermutet... Flint Marko! Peter nimmt dies dem Sandman persönlich. Er jagt ihm ziemlich nach, erfolglos. Nur für alle Fälle sitzt er vor dem Funkgerät. Schubst sogar MJ weg, als sie versucht ihn wegen des Bildes zur Rede zu stellen. Er schläft mit dem Funkgerät ein und das ist der perfekte Zeitpunkt für den Symbionten, um zum Zug zu kommen. Er wacht am nächsten Morgen hoch über den Dächern der Stadt in seinem schwarzen Kostüm auf. Mit der Kraft, die ihm das Kostüm verleiht macht er Sandman leicht ausfindig und ein gewaltiger Kampf findet statt, der schließlich dazu führt, dass Sandman eine Ladung Wasser abbekommt.
Spider-Man geht zurück zur Wohnung, wo er auf diesen russischen Typen trifft, der ihm wegen der Miete auf die Nerven geht... nur diesmal macht sich Peter nichts draus. Er leuchtet dem Typen heim und man sieht einen Hinweis auf die wahre Gestalt des außerirdischen Symbionten, mit den Zähnen usw., bevor er ihn (den Symbionten) ablegt. MJ bekommt einen neuen Job und geht zum ersten Mal zu Harry nachdem Peter sie abweist. In diesem Moment beginnt Harry sich an alles zu erinnern. MJ und Harry küssen sich und sie stürzt aus der Türe nachdem ihr bewusst wurde, was sie getan hat. Als sie in ihre Wohnung zurückkehrt, wartet jemand auf sie: der Grüne Kobold II. Er bringt sie dazu, sich irgendwo mit Peter zu verabreden, damit er sie mit der Drohung Peter zu verletzen zwingen kann, mit Peter Schluss zu machen und mit ihm zu gehen. Peter leidet unter der blinden Wut, die das außerirdische Kostüm an den Tag legt, es ist ihm aber egal. Er stellt Brock zur Rede, der Bilder von Spider-Man gefälscht hat. Peter beweist dies, stellt ihn vor Zeitungsverleger J. Jonah Jameson (J. K. Simmons) bloß und veranlasst dadurch, dass er gefeuert wird. Peter bringt das Kostüm auch zu Dr. Connors, der jede Menge Echsen-Kram an der Wand hat... Hinweis, Hinweis!
Am nächsten Tag geht er mit Gwen aus, und zwar dorthin, wo MJ als Sängerin auftritt. Ihr Vater macht sie dort wegen Kohle dumm an. Er (Peter) raubt ihr das Rampenlicht und Gwen kapiert, dass er das nur tut, um MJ zurückzugewinnen, und sie rennt raus. Peter kümmert sich einen Scheiß drum und geht auf alle los. MJs Vater gefällt das nicht und er geht auf ihn zu. Er wirft ihn beiseite, kurz nachdem er MJ schlägt. Ihm wird bewusst, dass es das Kostüm ist, das ihn diese Dinge tun lässt und er beschließt es loszuwerden. So schwingt er auf die Spitze einer Kirche und versucht erfolglos es loszuwerden. Sauer darüber, dass Spider-Man ihm seine Ex-Freundin ausgespannt hat und dass er wegen Peter Parker gefeuert wurde, geht Brock in die Kirche, um sich umzubringen. Es trifft sich aber gut für ihn, dass er in der Kirche ist. Außerdem trifft es sich gut, dass die Kirchenglocke läutet und das Kostüm wegschmilzt... und in Brocks Händen landet: Venom ist geboren!
Venom findet Sandman und verbündet sich mit ihm, um Spider-Man zu beseitigen. Sie entführen Gwen Stacy und bringen sie auf ein 70 Stockwerke hohes Gebäude für die klassische Sturz-Szene. Sandman und Venom schlagen Spider-Man zu Brei, was dazu führt, dass MJ Harry darum bittet, ihm zu helfen. Er kommt zur Hilfe, als Venom gerade dabei ist ihn (Spider-Man) aufzuspießen. Mit einer Kürbisbombe nach der anderen wütet der Kampf. Gwen stürzt und kurz vorm Tod wird sie gerettet, ohne einen Genickbruch zu erleiden. Sie will ihn wieder küssen, doch Spider-Man weist sie ab. Venom will Spider-Man wieder aufspießen, doch Harry kommt ihm in die Quere und übernimmt die Kontrolle.
Es gibt eine Nebenhandlung über den Sandman, laut der er all die Verbrechen begeht, um Geld für die Gesundheit seines Kindes zu besorgen, aber wen interessiert das schon. Übrigens, das Kind ist es auch, das Sandman sagt, er soll aufhören Spider-Man zu verhauen. Peter erinnert sich an die Glocke und fängt an sie zu läuten, so dass der Lärm ihm hilft den Kampf zu gewinnen.
MJ, Gwen und Peter leben immer noch, aber Harry leider nicht mehr. Zumindest verzieh Harry Peter bevor er starb.